PCR教學試劑盒
Cat. #：P8021，P8022
産品簡介
本試劑盒是(shì)按照教學實驗内容設計的(de)，符合标準擴增流程的(de)，教學用PCR反應試劑盒。本試劑盒所提供的(de)模闆爲(wéi / wèi)插入特定大(dà)小DNA片段的(de)PBluescipt SK（+）重組質粒；引物爲(wéi / wèi)根據所插入DNA序列和(hé / huò)擴增片段大(dà)小不(bù)同設計的(de)上(shàng)下遊引物。PCR結果可獲得特定大(dà)小（500 bp或1,000 bp）的(de)PCR産物。
産品組成
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Component |
P8021 （500 bp，30次） |
P8022 （1,000 bp，30次） |
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DNA模闆 |
150 μl，500 bp |
150 μl，1,000 bp |
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上(shàng)遊引物 (10 μM) |
75 μl |
75 μl |
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下遊引物(10 μM) |
75 μl |
75 μl |
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dNTP混合物(2.5 mM) |
150 μl |
150 μl |
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Taq DNA聚合酶(2.5 U/μl) |
40 μl |
40 μl |
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10×PCR緩沖液 |
500 μl |
500 μl |
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超純水 |
1 ml |
1 ml |
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說(shuō)明書 |
1份 |
1份 |
活性定義
一(yī / yì ／yí)個(gè)活性單位（U）指用活性化的(de)大(dà)馬哈魚精子(zǐ)DNA作爲(wéi / wèi)模闆/引物，在(zài)72℃、30 min内，攝入10 nmol全核苷酸所需的(de)酶量。
保存條件
10×PCR緩沖液保存于(yú)4℃，其他(tā)成分-20℃保存。
質量控制
純度檢測：經質量檢測，産品不(bù)含脫氧核糖核酸内切酶、脫氧核糖核酸外切酶和(hé / huò)核糖核酸酶污染。
功能檢測：PCR方法檢測本試劑盒無宿主殘餘DNA，也(yě)無其他(tā)DNA污染，能有效完成PCR擴增。
應用舉例
1. 配制反應體系
請于(yú)冰上(shàng)配置反應體系，體系大(dà)小與組分用量與添加順序可調整：
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Ordinal |
Component |
Volume (25 μl reaction volume) |
Volume (50 μl reaction volume) |
Volume (50 μl reaction volume，n管) |
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1 |
10×PCR緩沖液（Mg2+ Plus） |
2.5 μl |
5 μl |
5×(n+1) μl |
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2 |
dNTPs（2.5mM） |
2 μl |
4 μl |
4×(n+1) μl |
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3 |
上(shàng)遊引物 (10 μM) |
1 μl |
2 μl |
2×(n+1) μl或a μl×(n+1) |
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4 |
下遊引物 (10 μM) |
1 μl |
2 μl |
2×(n+1) μl或a μl×(n+1) |
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5 |
Taq DNA聚合酶（2.5U/μl） |
0.5 μl |
1 μl |
1×(n+1) μl或a μl×(n+1) |
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6 |
template DNA |
2 μl |
4 μl |
4×(n+1) μl或a μl×(n+1) |
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7 |
超純水 |
16 μl |
32 μl |
32×(n+1) μl |
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8 |
石蠟油 |
如不(bù)能設置頂蓋溫度，需适量加入石蠟油。 |
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● 加入各組分後，請用槍頭反複吸吹幾次，充分混勻。
● 在(zài)一(yī / yì ／yí)次配制多管需分裝時(shí)建議按（n+1）的(de)反應液量配制，以(yǐ)确保分配時(shí)的(de)耗損不(bù)會影響實驗，同時(shí)選擇大(dà)于(yú)總體積的(de)離心管便于(yú)混勻。
● 如需使用其他(tā)體積的(de)PCR反應體系，請按各組分比例縮減或增加各組分用量。
● 組分中引物、DNA模闆、Taq DNA聚合酶常用于(yú)梯度實驗，如有調整，請注意調超純水的(de)用量至相應的(de)體系。
● 将混勻的(de)各管短暫離心，置于(yú)PCR儀中。
2. 設定反應程序進行PCR反應
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Stage |
Temperature |
Time |
Number of Cycles |
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Initial Denaturation |
94℃ |
3 min |
1 |
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Denaturation |
94℃ |
30 sec |
30 |
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Annealing |
55℃ |
30 sec |
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Extension |
72℃ |
30 sec or 45 sec |
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Final Extension |
72℃ |
5 min |
1 |
● 設定PCR程序時(shí)，請根據目的(de)片段大(dà)小決定延伸時(shí)間，如果目的(de)片段大(dà)小爲(wéi / wèi)500 bp時(shí)，延伸時(shí)間爲(wéi / wèi)30 sec，目的(de)片段爲(wéi / wèi)1 kb時(shí)，延伸時(shí)間爲(wéi / wèi)45 sec。
3. 分析結果
反應結束後取2-5 μl反應産物與loading buffer混勻後進行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像設備觀察目的(de)條帶的(de)擴增情況。
● 500 bp産物建議電泳條件爲(wéi / wèi)1.7%瓊脂糖凝膠，0.5×TBE，7 V/cm，20-40 min，建議Marker爲(wéi / wèi) DSTM 2000（M1101）。
● 1 kb産物建議電泳條件爲(wéi / wèi)1.0%瓊脂糖凝膠，1×TAE，7 V/cm，20-40 min，建議Marker爲(wéi / wèi) DSTM 5000（M1111）。
注意事項
請嚴格按照說(shuō)明書提供的(de)實驗體系及實驗條件進行試驗。
室溫下Taq DNA聚合酶有一(yī / yì ／yí)定的(de)活性，爲(wéi / wèi)避免發生非特異性擴增，請于(yú)冰上(shàng)配置反應體系，并且最後添加Taq DNA聚合酶或模闆DNA。
挑取菌落時(shí)，應選擇單菌落，不(bù)要(yào / yāo)挑取太多菌體，以(yǐ)免影響PCR結果。