産品中心

通用RNA提取試劑盒

産品組分

需要(yào / yāo)自備的(de)溶液

●  氯仿

●  無水乙醇

産品說(shuō)明

通用RNA提取試劑盒是(shì)經過改進開發的(de)新一(yī / yì ／yí)代産品，提高了(le／liǎo)裂解液的(de)裂解能力和(hé / huò)提取的(de)靈敏度，通過在(zài)特定适宜的(de)條件下特異、可逆地(dì / de)結合RNA，而(ér)各種蛋白質和(hé / huò)其他(tā)雜質均可被去除掉，同時(shí)改進的(de)矽基質膜增強了(le／liǎo)對RNA的(de)吸附能力，得到(dào)的(de)RNA純度更好，質量更高。該試劑盒可從各種細胞或組織中快速提取總RNA，每個(gè)吸附柱每次可處理50–100 mg 組織或5×10⁶ 細胞，可同時(shí)處理大(dà)量不(bù)同樣品，一(yī / yì ／yí)個(gè)小時(shí)内即可完成反應。提取的(de)總RNA沒有DNA和(hé / huò)蛋白的(de)污染，可用于(yú)Northern blot、Dot blot、polyA 篩選、體外翻譯、RNase保護分析和(hé / huò)分子(zǐ)克隆等。

保存條件

溶液RL應在(zài)2-8℃避光保存，其他(tā)溶液和(hé / huò)純化柱室溫保存。

注意事項---------------------------------------------------------------------------------------------------------
●  初次使用溶液RPI和(hé / huò)溶液RW前，需按比例加入無水乙醇。18 ml溶液RPI中加入12 ml無水乙醇（3:2），12 ml溶液RW中加入48 ml無水乙醇（1:4）。

●  嚴防操作環境、使用的(de)容器、耗材和(hé / huò)試劑的(de)RNase污染。操作過程中勤換手套。

●  使用本産品提取的(de)RNA一(yī / yì ／yí)般不(bù)含有DNA污染。在(zài)極少數情況下（與組織pH值等相關），如果有DNA污染而(ér)又必須去除，則可以(yǐ)用RNase-free的(de)DNase處理樣品。

●  請嚴格遵照操作步驟操作。

●  不(bù)同起始材料的(de)用量及溶液RL的(de)用量不(bù)同（參見下表），過多或過少的(de)使用量都可能影響RNA的(de)質量或産量。若起始材料量很少，RNA預計産量很低，在(zài)異丙醇沉澱時(shí)，可加入20mg/ml的(de)肝糖原溶液0.5-1 μl促進RNA沉澱。

●  有關RNA的(de)吸光度說(shuō)明如下：

260nm、320nm、230nm、280nm下的(de)吸光度分别代表核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和(hé / huò)蛋白質等有機物的(de)污染程度，質量較好的(de)RNA的(de)R值應在(zài)1.8-2.0之(zhī)間，當R<1.8時(shí)，溶液中的(de)蛋白質等有機物的(de)污染比較明顯；當>2.2時(shí)，說(shuō)明RNA已經被水解成單核苷酸。

●  RNA濃度=（OD₂₆₀-OD₃₂₀）*稀釋倍數*0.04 μg/μl。

操作步驟---------------------------------------------------------------------------------------------------------

第一(yī / yì ／yí)次使用前應在(zài)溶液 RPI、溶液 RW中加入無水乙醇，加入量請參見瓶上(shàng)标簽。

1.  樣品處理

● 組織：将組織在(zài)液氮中磨碎。每50–100 mg組織加1 ml溶液RL，用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不(bù)應超過溶液RL體積的(de)十分之(zhī)一(yī / yì ／yí)。

● 單層培養細胞：直接在(zài)培養闆中加入溶液RL裂解細胞，每10 cm² 面積加1 ml溶液RL。用取樣器抽打幾次。

●  溶液RL的(de)加入量根據培養瓶面積決定，不(bù)是(shì)由細胞數決定。如果加量不(bù)足，可能導緻提取的(de)RNA中有DNA污染。

c.  細胞懸液：離心取細胞，棄上(shàng)清。每5–10×10⁶動物細胞和(hé / huò)植物細胞加入1 ml溶液RL。加溶液RL前不(bù)要(yào / yāo)洗滌細胞，以(yǐ)免降解mRNA。

2.  将勻漿樣品在(zài)15–30℃放置5 min，使得核酸蛋白複合物完全分離。

3.  可選步驟：4℃ 12,000 rpm (~13,400×g) 離心5分鍾，取上(shàng)清，轉入一(yī / yì ／yí)個(gè)新的(de)無RNase的(de)離心管中。

●  如果樣品中含有較多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物結節部分等，可加此步驟離心去除。離心得到(dào)的(de)沉澱中包括細胞外膜、多糖、高分子(zǐ)量DNA，RNA存在(zài)于(yú)上(shàng)清溶液中。

（如樣品含有較多多糖多酚，請增加以(yǐ)下步驟，在(zài)上(shàng)清液中加入0.2×上(shàng)清液體積的(de)5 M NaCl及1×上(shàng)清液體積的(de)酚/氯仿（1:1），混勻，12000 rpm 離心5-10 min ，取上(shàng)清液加入等體積氯仿，混勻，12000 rpm 離心5-10 min，至第4步。）

4.  加入200 μl氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min。

5.  4℃ 12,000 rpm離心10 min，樣品會分成三層，從上(shàng)至下依次是(shì)：無色的(de)水相，白色的(de)中間層和(hé / huò)黃色的(de)有機相，RNA主要(yào / yāo)存在(zài)于(yú)水相中，水相的(de)體積約爲(wéi / wèi)所用溶液RL試劑的(de)60%。把水相轉移到(dào)新管中，進行下一(yī / yì ／yí)步操作。注意不(bù)要(yào / yāo)吸到(dào)中間層。

●  第一(yī / yì ／yí)次使用前應在(zài)溶液 RPI、溶液RW中加入無水乙醇，加入量請參見瓶上(shàng)标簽。

6.  緩慢加入0.5 倍體積無水乙醇，混勻（此時(shí)可能會出(chū)現沉澱）。将得到(dào)溶液和(hé / huò)沉澱一(yī / yì ／yí)起轉入純化柱中，4℃ 12,000 rpm離心30 s。4℃ 12,000 rpm離心30 s，棄掉收集管中的(de)廢液。
●  若溶液體積大(dà)于(yú)純化柱容積（700 μl），可分兩次離心。

7.  向純化柱中加入500 μl溶液RPI（使用前請先檢查是(shì)否已加入乙醇），4℃ 12,000 rpm離心30 s，棄廢液。    

8.  向純化柱中加入500 μl溶液RW（使用前請先檢查是(shì)否已加入乙醇），室溫靜置2 min， 4℃ 12,000 rpm離心30 s，棄廢液。

9.  向純化柱中加入500 μl溶液RW，室溫靜置2分鍾，4℃ 12,000 rpm離心30 s，去除殘餘液體。

10.  将純化柱放入2ml收集管中，4℃ 12,000 rpm離心2 min，去除殘餘液體。

●  此步驟的(de)目的(de)是(shì)将純化柱中殘餘的(de)漂洗液去除，離心後将純化柱在(zài)室溫放置片刻，或置于(yú)超淨工作台上(shàng)通風片刻，以(yǐ)充分晾幹。如果有漂洗液殘留，可能會影響後續的(de)RT等實驗操作。

11.  将純化柱轉入一(yī / yì ／yí)個(gè)新的(de)離心管中，加30–100 μl RNase-free ddH₂O，室溫放置2 min，4℃ 12,000 rpm離心2 min。

●  洗脫緩沖液體積不(bù)應少于(yú)30 μl，體積過小影響回收效率。且RNA應保存在(zài)-70℃（-80℃），以(yǐ)防降解。

●  如果想提高RNA得率，可重複上(shàng)步操作一(yī / yì ／yí)次，合并兩次得到(dào)的(de)溶液。