TRAzol
産品說(shuō)明
TRAzol可以(yǐ)從動物組織、植物材料、各種微生物以(yǐ)及培養細胞等組織材料中提取總RNA。樣品在(zài)TRAzol中能夠充分被裂解，在(zài)加入氯仿離心後，溶液會形成上(shàng)清層、中間層和(hé / huò)有機層（下層），RNA分布在(zài)上(shàng)清層中，收集上(shàng)清層後，經異丙醇沉澱便可以(yǐ)回收得到(dào)總RNA。經本制品提取的(de)總RNA純度高，基本不(bù)含蛋白質及基因組DNA，提取的(de)RNA可以(yǐ)直接用于(yú)Northern雜交、斑點雜交、mRNA純化、體外翻譯、RNA分解酶的(de)保護分析、RT-PCR、構建cDNA文庫等各種分子(zǐ)生物學實驗。
産品組分
|
貨号 |
R1021（20次） |
R1022（100次） |
|
TRAzol |
20 ml |
100 ml |
|
說(shuō)明書 |
1份 |
1份 |
需要(yào / yāo)自備氯仿、異丙醇、RNase-free 75%乙醇、DEPC處理水（R2041/R2042）
保存條件
室溫運輸，2-8℃避光保存。
注意事項
● TRAzol具有腐蝕性，操作過程中應做好防護，避免直接接觸皮膚或吸入口鼻。沾染後應立即用大(dà)量清水沖洗，必要(yào / yāo)時(shí)請就(jiù)醫處理。
● 嚴防操作環境、使用的(de)容器、耗材和(hé / huò)試劑的(de)RNase污染。操作過程中勤換手套。
● 根據起始材料量的(de)不(bù)同使用不(bù)同體積的(de)溶液（見下表）。過多或過少的(de)使用量都可能影響RNA的(de)質量或産量。若起始材料量很少，RNA預計産量很低，在(zài)異丙醇沉澱時(shí)，可加入20 mg/ml肝糖原溶液0.5-1 μl促進RNA沉澱。
● 不(bù)同起始材料試劑用量及TRAzol用量。
|
樣品用量 |
TRAzol的(de)用量 |
|
10cm2的(de)貼壁培養細胞 |
1 ml |
|
107的(de)懸浮培養細胞 |
1-2 ml |
|
100 μl的(de)白細胞 |
2 ml |
|
50-100 mg的(de)普通組織樣品 |
1 ml |
|
50-100 mg的(de)特殊組織樣品（肝、脾、骨及軟骨等） |
2 ml |
|
15-30 mg的(de)植物材料（多糖和(hé / huò)多酚含量不(bù)高的(de)） |
1 ml |
● 使用本産品提取的(de)RNA一(yī / yì ／yí)般不(bù)含有DNA污染。在(zài)極少數情況下（與組織pH值等相關），如果有DNA污染而(ér)又必須去除，則可以(yǐ)用RNase-free的(de)DNase處理樣品。
● 防止DNA污染方法：a. 減少樣本起始用量，如将100 mg的(de)植物組織減少爲(wéi / wèi)50 mg，将30 mg的(de)動物組織減少爲(wéi / wèi)10 mg；
b. 在(zài)加入TRAzol之(zhī)後加入5-10 ul 3M NaAc(pH5.2)。
● 請嚴格遵照操作步驟操作。
● 有關RNA的(de)吸光度說(shuō)明如下：
260 nm、320 nm、230 nm、280 nm下的(de)吸光度分别代表了(le／liǎo)核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和(hé / huò)蛋白質等有機物的(de)吸光度值。OD260/OD280（R）體現了(le／liǎo)RNA中的(de)蛋白質等有機物的(de)污染程度，質量較好的(de)RNA的(de)R值應在(zài)1.8-2.0之(zhī)間，當R<1.8時(shí)，溶液中的(de)蛋白質等有機物的(de)污染比較明顯；當R>2.2時(shí)，說(shuō)明RNA已經被水解成了(le／liǎo)單核苷酸。在(zài)對核酸進行吸光度檢測時(shí)，需要(yào / yāo)注意稀釋液應使用TE Buffer。
● RNA濃度=（OD260-OD320）×稀釋倍數×0.04 μg/μl
操作步驟
1. 實驗樣品的(de)研磨和(hé / huò)勻漿
A. 貼壁培養細胞
倒出(chū)培養液，用1X PBS清洗一(yī / yì ／yí)次，每10 cm2生長的(de)培養細胞中加入1ml的(de)TRAzol，水平放置片刻，使裂解液均勻分布于(yú)細胞表面并裂解細胞，然後使用移液槍吹打細胞使其脫落（對于(yú)貼壁牢固的(de)培養細胞可用細胞刮勺剝離細胞）。将内含細胞的(de)裂解液轉移至離心管中，用移液槍反複吹吸直至裂解液中無明顯沉澱。室溫靜置5 min。
B. 懸浮培養細胞
将懸浮培養細胞連同培養液一(yī / yì ／yí)起倒入離心管中，8,000 rpm，4℃離心2 min，棄上(shàng)清，向每107個(gè)細胞中加入l-2 ml的(de)TRAzol。用移液槍反複吹吸直至裂解液中無明顯沉澱，室溫靜置5 min。
C. 動物組織、植物材料樣品
将超低溫凍結的(de)RNA提取樣品稱量後迅速轉移至用液氮預冷的(de)研缽中，用研杵研磨組織，其間不(bù)斷加入液氮，直至研磨成粉末狀（無明顯的(de)可見顆粒，如果沒有研磨徹底會影響RNA的(de)收率和(hé / huò)質量）。對于(yú)普通的(de)RNA提取樣品，可以(yǐ)向研缽中加入适量的(de)TRAzol，将研磨成粉末狀的(de)樣品完全覆蓋，然後室溫靜置，直至樣品完全融化，再用研杵繼續研磨至裂解液呈透明狀。對于(yú)特殊樣品，如肝、脾、骨及軟骨等，可以(yǐ)将研磨成粉末狀的(de)樣品加入到(dào)含有适量的(de)TRAzol的(de)勻漿管中，把勻漿管置于(yú)冰浴中進行勻漿，直至勻漿液呈無顆粒透明狀。将勻漿液轉移至離心管中，室溫靜置5 min。12,000 rpm 4 ℃離心5 min，小心吸取上(shàng)清液，移入新的(de)離心管中（切勿吸取沉澱）。
2. Total RNA的(de)提取
1 向上(shàng)述步驟中的(de)勻漿裂解液中加入氯仿（TRAzol的(de)1/5體積量），蓋緊離心管蓋，用力振蕩（氯仿沸點低、易揮發，振蕩時(shí)應小心離心管蓋突然彈開）。待充分乳化溶液呈乳白狀（無分相現象）後，再室溫靜置2 min。
2 12,000 rpm 4 ℃離心10 min。
3 從離心機中小心取出(chū)離心管，此時(shí)勻漿液分爲(wéi / wèi)三層，即：無色的(de)上(shàng)清液、中間的(de)白色層及帶有顔色的(de)下層有機相，吸取上(shàng)清液轉移至另一(yī / yì ／yí)新的(de)離心管中（切忌吸出(chū)白色中間層）。
（如樣品含有較多多糖多酚，請增加以(yǐ)下步驟：在(zài)上(shàng)清液中加入0.2X上(shàng)清液體積的(de)5 M NaCl及1X上(shàng)清液體積的(de)酚/氯仿（1:1），混勻，12000 rpm離心5-10 min ，取上(shàng)清液加入等體積氯仿，混勻，12000 rpm 離心 5-10 min，至第4步。）
4 向上(shàng)清中加入等體積的(de)異丙醇，上(shàng)下颠倒離心管充分混勻後，在(zài)15-30℃下靜置10 min。
5 12,000 rpm 4℃離心10 min。一(yī / yì ／yí)般在(zài)離心後，試管底部會出(chū)現沉澱。
3. RNA沉澱的(de)清洗
小心棄去上(shàng)清，緩慢地(dì / de)沿離心管壁加入75％的(de)乙醇1 ml（切勿觸及沉澱），輕輕上(shàng)下颠倒洗滌離心管管壁，12,000 rpm，4 ℃離心2 min後小心棄去乙醇（爲(wéi / wèi)了(le／liǎo)更好地(dì / de)控制RNA中的(de)鹽離子(zǐ)含量，應盡量除淨乙醇），重複洗滌一(yī / yì ／yí)次。
4. RNA的(de)溶解
室溫幹燥沉澱2-5 min（不(bù)可以(yǐ)離心或加熱幹燥，否則RNA将會很難溶解），加入适量的(de)RNase-free水溶解沉澱，必要(yào / yāo)時(shí)可用移液槍輕輕吹打沉澱，待RNA沉澱完全溶解後于(yú)-80℃保存。