Pfu Mix
Cat. #：P2021，P2022
産品簡介
Pfu Mix是(shì)2×濃縮的(de)PCR擴增預混和(hé / huò)溶液，含有Pfu DNA聚合酶、dNTP混合物、緩沖液等PCR擴增必需組分（模闆與引物除外）。使用時(shí)，僅需在(zài)擴增體系中加入模闆和(hé / huò)引物即可進行PCR，大(dà)大(dà)簡化操作過程，縮短操作時(shí)間，降低污染（加樣次數減少）。同時(shí)，由于(yú)體系内含有優化劑與增強劑，能夠顯著增強PCR擴增的(de)靈敏度。擴增産物具有平末端。
Pfu DNA聚合酶是(shì)極端嗜熱性細菌Pyrococcus furiosus來(lái)源的(de)高度熱穩定DNA聚合酶，分子(zǐ)量爲(wéi / wèi)90 KD。其保真性是(shì)普通Taq DNA聚合酶的(de)10倍左右。擴增片段的(de)長度可達5 kb（簡單模闆）。延伸速度爲(wéi / wèi)2min/kb（70-75℃，簡單模闆可達20s/kb）。該酶具有5’→3’聚合酶活性和(hé / huò)3’→5’外切酶活性。
産品組成
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Component |
P2021 |
P2022 |
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2× Pfu Mix |
1 ml |
1 ml× 5 |
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超純水 |
1 ml |
1 ml× 5 |
本産品分含體系中包含溴酚藍、不(bù)含溴酚藍兩類。體系中包含溴酚藍的(de)産品，PCR擴增産物可直接電泳檢測。這(zhè)兩類産品的(de)擴增性能無差異。如無特别說(shuō)明提供體系中包含溴酚藍的(de)包裝。
保存條件
-20℃保存2年。
質量控制
純度檢測：經質量檢測，産品不(bù)含脫氧核糖核酸内切酶、脫氧核糖核酸外切酶和(hé / huò)核糖核酸酶污染。
功能檢測：PCR方法檢測無宿主殘餘DNA，能有效擴增人(rén)基因組中的(de)單拷貝基因。
應用舉例
1. 配制反應體系
請于(yú)冰上(shàng)配置反應體系，體系大(dà)小與組分用量與添加順序可調整：
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Ordinal |
Component |
Volume (50 μl reaction volume) |
Final concentration (50 μl reaction volume) |
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1 |
2× Pfu Mix |
25 μl |
1× |
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2 |
upstream primer (10 μM)[1] |
2 μl |
0.4 μM |
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3 |
downstream primer (10 μM)[1] |
2 μl |
0.4 μM |
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4 |
template DNA[2] |
1-4 μl |
<1μg |
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5 |
超純水[3] |
To 50 μl |
- |
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optional |
MgCl2(MgSO4)/PCR Enhancer[4] |
Variable |
- |
[1] 引物終濃度建議範圍：0.1-1 μM。特異性差時(shí)可降低濃度，效率低時(shí)可提高濃度。
[2] 不(bù)同模闆最佳用量不(bù)同，部分DNA模闆建議用量如下表（50 μl反應體系）。
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Template |
人(rén)類基因組DNA |
λDNA |
大(dà)腸杆菌基因組DNA |
質粒DNA |
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Dosage |
0.1μg-1μg |
0.5ng-5ng |
10ng-100ng |
0.1ng-10ng |
[3] 可單獨訂購超純水（Cat. #：P9021/P9022/P9023）。
[4] 可單獨訂購25mM MgCl2（Cat. #：P9031）和(hé / huò)PCR Enhancer（Cat. #：P9041）。
2. 設定反應程序進行PCR反應
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Stage |
Temperature |
Time |
Number of Cycles |
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Initial Denaturation |
94℃ |
3 min |
1 |
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Denaturation |
94℃ |
30 sec |
25-35 |
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Annealing |
55-68℃[1] |
30 sec |
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Extension |
72℃ |
Variable[2] |
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Final Extension |
72℃ |
5-10 min |
1 |
[1] 退火溫度應根據Tm值較低的(de)引物來(lái)設。
[2] 延伸時(shí)間按2min/kb來(lái)設最佳（簡單模闆可達20s/kb）。
3. 分析結果
反應産物可直接進行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像設備觀察目的(de)條帶的(de)擴增情況。如有需要(yào / yāo)，可進行割膠回收。
無産物或産物量少的(de)改進措施有：1調整退火溫度；2減少抑制劑的(de)影響，如提取的(de)基因組DNA中含有抑制擴增的(de)成分，需要(yào / yāo)高倍稀釋（1: 10000）後使用；3采用乙醇沉降洗脫，提高模闆DNA的(de)純度；4使用PCR添加劑，如PCR Enhancer（Cat. #：P9041）、MgCl2（Cat. #：P9031）等可提高産量。
操作注意事項
1 室溫下Pfu DNA聚合酶有一(yī / yì ／yí)定的(de)活性，爲(wéi / wèi)避免發生非特異性擴增，請于(yú)冰上(shàng)配置反應體系，并且最後添加Pfu DNA聚合酶或模闆DNA。
2 Pfu DNA聚合酶的(de)擴增産物隻有平末端，可直接用于(yú)平末端連接。如要(yào / yāo)進行TA克隆，請先進行加A反應，以(yǐ)提高克隆效率。（加A反應：參考如下體系，72℃，15-30min）
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PCR（純化）産物 |
1-7 μl |
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10× Taq Buffer（Mg2+ Plus） |
1 μl |
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dATP |
0.2 mM |
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Taq DNA聚合酶 |
5U |
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超純水 |
To 10 μl |
3 堿基出(chū)錯率是(shì)指在(zài)每個(gè)堿基合成過程中所摻入的(de)錯誤核苷酸數目。Pfu DNA聚合酶的(de)堿基錯誤率爲(wéi / wèi)1×10-6。
4 dUTP、dITP和(hé / huò)含有這(zhè)些核苷酸的(de)引物不(bù)能用于(yú)Pfu DNA聚合酶催化的(de)PCR擴增。因爲(wéi / wèi)該酶與含有尿嘧啶和(hé / huò)次黃嘌呤的(de)DNA模闆結合後會中止DNA聚合反應。
引物設計注意事項
引物長度一(yī / yì ／yí)般在(zài)15-30個(gè)堿基之(zhī)間；上(shàng)下遊引物3’末端避免互補，避免出(chū)現3個(gè)以(yǐ)上(shàng)重複的(de)G或C，或出(chū)現發夾結構，否則會産生非特異性擴增；GC含量控制在(zài)40-60%，且上(shàng)下遊引物GC含量盡量接近；Tm值控制在(zài)55-65℃之(zhī)間，且上(shàng)下遊引物Tm值盡量接近，額外附加序列（酶切位點、修飾等）是(shì)非模闆匹配序列，不(bù)參與Tm值計算。
相關産品
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名稱 |
貨号 |
規格 |
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PCR Mix |
P2011/P2012/P2013/P2014/P2015 |
1ml/5ml/10ml/50ml/100ml |
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Power Green qPCR Mix |
P2101/P2102/P2103/P2104/P2105 |
1ml/5ml/10ml/50ml/100ml |
|
1kb ladder |
M1181/M1182 |
50次/250次 |
|
DSTM5000 |
M1111/M1112 |
60次/300次 |
|
高純度質粒小提試劑盒 |
N1011/N1012/N1013 |
50次/100次/200次 |
|
通用RNA提取試劑盒 |
R1051 |
50次 |
|
基因組DNA快速提取試劑盒 |
N1111/N1112 |
50次/100次 |
|
DNA凝膠回收試劑盒 |
N1071/N1072/N1073 |
50次/100次/200次 |
|
RT-PCR Kit |
R1011/R1012 |
20次/100次 |
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