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RT-PCR Kit（逆轉錄試劑盒）

産品說(shuō)明

RT-PCR Kit(逆轉錄試劑盒）是(shì)專爲(wéi / wèi)兩步法RT-PCR第一(yī / yì ／yí)步實驗配制的(de)、具有高靈敏度的(de)RT-PCR反應系統。該系統合理配備了(le／liǎo)與cDNA第一(yī / yì ／yí)鏈合成反應相關的(de)各種組分，優化的(de)體系保證了(le／liǎo)M-MLV具有高效的(de)逆轉錄酶活性，所得cDNA對後續的(de)PCR或定量PCR實驗兼容性好，可用于(yú)檢測稀有基因的(de)表達、從極少數細胞中定量檢測特定mRNA的(de)表達水平、克隆特定基因的(de)cDNA片段等。

M-MLV逆轉錄酶是(shì)由一(yī / yì ／yí)個(gè)71 kD的(de)單亞基組成的(de)重組型DNA逆轉錄聚合酶。可以(yǐ)催化以(yǐ)RNA或DNA：RNA雜交鏈爲(wéi / wèi)模闆的(de)互補DNA 的(de)聚合反應。本酶經修飾RNase H活性比普通的(de)逆轉錄酶要(yào / yāo)弱很多，因此在(zài)合成第一(yī / yì ／yí)鏈cDNA的(de)過程中，可保證RNA的(de)降解程度較低，從而(ér)使得率提高。

産品組分

R1011可進行20次逆轉錄反應,R1012可進行100次逆轉錄反應（20 μl 标準PCR反應體系，每次使用 M-MLV 1μl）。

M-MLV 儲存液

20 mM Tris-HCl (pH 7.5)

200 mM NaCl

0.1 mM EDTA

1 mM DTT

0.01% NP-40

50% glycerol

5xfirst-strand buffer 成分

250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)

375 mM KCl

15 mM MgCl2

50 mM DTT

質量檢測

逆轉錄酶活性檢測

使用[32P]dCTP作爲(wéi / wèi)标記，200 U的(de) M-MLV以(yǐ)1μg、1.2 kb的(de)RNA爲(wéi / wèi)模闆進逆轉錄反應，最低可得到(dào)120ng的(de)cDNA，所得cDNA長度 > 全長的(de)90%。

核酸外切酶活性檢測

混合50ng的(de)标記DNA 或RNA與200U M-MLV在(zài)1×反應緩沖液體系中，37℃溫浴1 h，檢測DNA和(hé / huò)RNA降解都不(bù)到(dào)總量的(de)1%。

适用範圍

第一(yī / yì ／yí)鏈cDNA 合成

cDNA文庫構建

RT-PCR

引物延伸

3'和(hé / huò)5' RACE

注意事項

l  成功的(de)cDNA合成來(lái)自高質量的(de)RNA。高質量的(de)RNA至少應保證全長的(de)完整性并且不(bù)含逆轉錄酶的(de)抑制劑，如EDTA或 SDS。用于(yú)cDNA合成反應的(de)溶液試劑盡可能用DEPC進行處理，并在(zài)高壓滅菌後使用。有些試劑不(bù)能用高壓滅菌處理時(shí)，首先用經過滅菌的(de)器具、水等配制溶液後，再将溶液進行過濾除菌處理。

l  爲(wéi / wèi)了(le／liǎo)增加貯存RNA樣品的(de)穩定性，可以(yǐ)将RNA溶解在(zài)去離子(zǐ)的(de)甲酰胺中，存于(yú)-70℃。用于(yú)保存 RNA 的(de)甲酰胺一(yī / yì ／yí)定不(bù)能含有降解RNA的(de)雜物。來(lái)源于(yú)胰髒的(de)RNA至少可以(yǐ)在(zài)甲酰胺中保存一(yī / yì ／yí)年。當準備使用RNA時(shí)，可以(yǐ)使用下列方法沉澱RNA：加入NaCl至0.2 M同時(shí)加入4倍體積的(de)乙醇，室溫放置3-5 min，10,000 rpm離心5 min。

l  在(zài)逆轉錄反應中經常加入RNase抑制劑（RNasin）以(yǐ)增加cDNA合成的(de)長度和(hé / huò)産量。在(zài)第一(yī / yì ／yí)鏈合成反應中，RNase抑制劑在(zài)緩沖液和(hé / huò)還原劑（如 DTT）存在(zài)的(de)條件下加入，因爲(wéi / wèi)cDNA合成前的(de)過程會使抑制劑變性，從而(ér)釋放出(chū)RNase。但是(shì)RNase抑制劑僅防止RNase A，B，C 對RNA的(de)降解，并不(bù)能防止皮膚上(shàng)的(de)RNase，因此盡管使用了(le／liǎo)RNase抑制劑，也(yě)要(yào / yāo)小心不(bù)要(yào / yāo)從手指上(shàng)引入RNase。

l  較高的(de)保溫溫度有助于(yú)RNA二級結構的(de)打開，增加反應的(de)産量。

l  使用簡單的(de)RNA純化方法即可獲得滿足RT-PCR反應的(de)RNA，但爲(wéi / wèi)了(le／liǎo)保證實驗的(de)成功率，建議使用GTC法（異硫氰酸胍法）制備的(de)高純度RNA。

l  爲(wéi / wèi)防止RNA降解，應盡量避免反複凍融，最好保存于(yú)-70℃。

l  最佳的(de)PCR反應條件，因PCR擴增儀的(de)不(bù)同而(ér)不(bù)同，所以(yǐ)在(zài)使用您的(de)樣品之(zhī)前最好先試做一(yī / yì ／yí)下control反應，以(yǐ)确定最佳的(de)PCR反應條件。

l  cDNA産物應置于(yú)-20℃保存。

l  當以(yǐ)cDNA爲(wéi / wèi)模闆進行PCR之(zhī)前，使用RNase H處理cDNA，可以(yǐ)提高PCR反應的(de)靈敏度。

操作步驟

1 在(zài)冰浴的(de)無菌離心管中配制下列混合物

1-5μg RNA

1μl Oligo(dT)₁₅ 或Random primer，

補RNase-free ddH₂O至13.4μl；

2進行變性退火反應

70℃溫浴5 min,

簡短離心後冰浴5 min；

3在(zài)上(shàng)述離心管中配制反轉錄反應液

4 μl  5×first-strand buffer

1 μl  dNTPs（10 mM each）

0.6μl  RNasin ,

1 μl   M-MLV；

4按下列條件進行反轉錄反應

Oligo (dT)₁₅ ：42℃溫浴60 min；

Random primer： 37℃溫浴60 min。

5終止反應

70℃溫浴5 min終止反應，置冰上(shàng)進行後續實驗或-20℃保存。

6用RNase-free ddH₂O将反應體系稀釋到(dào)50μl，取2-5μl進行PCR擴增反應。